2024-09-12
CRISPR Cas13a 시스템을 기반으로 한 Micropterus salmoides rhabdovirus 검출 방법의 구축
张敏琳, 黄??, 左小??, 梁建??, 梁凯珊, 单金红, 李宗??, 喻??, 罗丽??, ??杰, ?? 会宏, 王庆. 基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑??弹状病毒检测方法[J]. 水生生物学报, 2024, 48(2): 283-291. DOI: 10.7541/2023.2023.0199
미크로프테러스 살모이드 (Micropterus salmoides) 는 캘리포니아 바스 또는 미국 흑바스라고도 알려져 있으며 북미에서 자생하는 민물 물고기입니다.시장 수요가 높기 때문에 전 세계적으로 중요한 재배 어류가되었습니다.: micropterus salmoides는 단단한 고기, 뼈가 적고 맛이 맛있고 영양이 풍부하며 특히 단백질이 풍부하고 지방이 적어서 소비자들의 건강한 음식 수요를 충족시킵니다.시장 가격은 상대적으로 높고 고급 외식 시장에서 자주 사용됩니다.. 빠른 성장: 미크로포터스 살모이드스는 빠르게 성장하고 일반적으로 6-8 개월 내에 상품 사양에 도달 할 수 있습니다. 짧은 사이클 번식에 적합하며 투자 수익을 빠르게 실현 할 수 있습니다.강한 질병 저항성: 다른 재배 어류와 비교할 때, 미크로프터스 살모이드스는 환경에 적응력이 뛰어나고, 대규모 질병 발생이 적고, 번식 위험을 감소시킵니다.큰입이있는 바스는 은바람과 풀바람과 같은 다른 담수 물고기와 혼합 될 수 있습니다., 호수 생태적 균형을 이루고 자원의 활용을 극대화하고 번식 효율성을 더욱 향상시키는 데 도움이되는 요인입니다.그리고 최근 몇 년 동안 번식 규모가 급속도로 증가했습니다..
비록 미크로프터스 살모이드 (Micropterus salmoides) 는 비교적 질병에 내성이 있기는 하지만, 나쁜 번식 조건 하에서는 여전히 어떤 질병에 걸리기도 합니다.마이크로프터스 살모이드스 랩도바이러스 (MSRV) 는 매우 해롭다: 이 바이러스는 1991년 미국 플로리다에서 처음 발견되었습니다. 이 바이러스는 처음에는 야생 롱머스 바스 개체군에서 발견되었습니다.그리고 점차적으로 미국 내의 많은 담수 호수와 저수지로 퍼졌습니다., 큰입이있는 바스의 주요 병원체 중 하나가되었습니다.
병에 걸린 물고기의 임상 증상
A: 건강 한 대머리 바스, 화살표 는 황낭 을 나타냅니다. B: 병든 대머리 바스, 화살표 는 황낭 을 나타냅니다.
전염의 근원은 종종 감염된 기생충이나 성인 물고기, 오염된 물체 및 바이러스를 옮기는 야생 물고기입니다. 이 바이러스는 직접 접촉, 배설물 배출,물체, 그리고 열악한 물 품질 또는 높은 밀도 번식 조건에서 발생할 가능성이 높습니다. 확산 바이러스는 유년 물고기에게 졸음, 방황, 복부 부종 및 신체 왜곡을 일으킬 수 있습니다.,그리고 사망성 궤양과 여러 장기의 출혈을 유발합니다. 한번 감염되면 사망률은 90%를 넘습니다.
인위적으로 감염된 미크로프터스 살모이드의 임상 증상
A: 건강 한 대입어 바스; B, C, D: 인공적으로 감염 된 대입어 바스.
매년, MSRV로 인해 Micropterus salmoides 새끼의 30% 이상이 사라집니다. 현재 바이러스에 대한 치료 및 검출 방법은 아직 미숙합니다.치료할 특별한 약이 없습니다.따라서 바이러스를 감염되기 전에 적시에 발견하고 효과적인 예방 조치를 취하는 것이 매우 필요합니다. 이는 번식 과정에서 손실을 어느 정도 줄일 수 있습니다.
또한 현장 검출은 현존하는 검출 기술로 복잡한 검출 장비를 사용하지 않고는 수행하기가 어렵습니다.남중국농업대학 연구팀은 MIRA와 CRISPR 시스템을 결합한 새로운 탐지 방법을 개발했습니다.이 방법은 높은 특수성, 높은 민감성 및 간단한 조작을 가지고 있습니다.이는 MSRV의 검출 효율을 크게 향상시키고 또한 MSRV를 가능한 한 빨리 발견하고 예방 및 통제 조치를 취할 수 있습니다..
이 제품에서 사용되는 제품: RNA 동열 급 증폭 키트 (기본형) -II
MIRA 프라이머 조합 스크리닝
대상 염기서열을 포함하는 유전자 조각을 증폭시키기 위해 두 쌍의 다른 MIRA 프라이머를 사용했으며 증폭 된 제품은 아가로스 젤 전자 분해에 노출되었습니다.전극분석 그래프는 100 bp의 위치에 위치했습니다., 그리고 밝은 대역은 세 개의 경로 모두에 나타났습니다. 비특정 증폭 제품이 있음을 나타냅니다.경로 2와 3의 250 bp의 증폭 대상 대역은 각각 Image J 소프트웨어에 의해 정량적으로 분석되었습니다.분석 결과, 그레이 값이 낮을수록 프라이머 사용률이 높다는 결론을 내릴 수 있습니다.그게, 프라이머 특이 결합 증폭 효율이 높을수록 높습니다.
결과는 MIRA-F2 / R2 프라이머 페어를 사용할 때 특정 결합 증폭 효율이 높다는 것을 보여주었습니다.
MIRA 프라이머 페어 스크리닝 전극 분해 젤 이미지 및 회색 값 분석
a. 전소분석 경로 M: 2000 bp DNA 마커; 전소분석 경로 1. 부정적 DNA 샘플 증폭; 전소분석 경로 2.MIRA-F1/R1 프라이머 페어는 표적 파편을 증폭합니다 (224 bp 상자에 표시된 바와 같이)전자 분해 경로 3. MIRA-F2 / R2 프라이머 짝은 대상 조각 (255 bp 박스에서 표시 된 바와 같이) 을 증폭합니다.
CRISPR/Cas13a 탐지 시스템
CRISPR/Cas13a 탐지 시스템의 반응이 완료된 후, 결과를 관찰하기 위해 자외선으로 방사된다.
CRISPR/Cas13a 탐지 시스템-플루오레센스 밝기 다이어그램
1-3. RNA 표준을 추가한 전체 시스템; 4. crRNA가 추가되지 않았다; 5. Cas13a 단백질이 추가되지 않았다; 6. ssRNA 리포터 프로브가 추가되지 않았다; 7. 부정적인 통제
CRISPR/Cas13a-MSRV 최적 반응 시스템
우리는 RNA 표준과 증폭된 샘플 RNA를 사용하여 실험을 수행했습니다. 목표 RNA의 위치화 속도는 crRNA2보다 crRNA1보다 더 좋았습니다.crRNA1은 crRNA2보다 강한 최종 형광 신호를 가지고 있습니다.크라 RNA1+크라 RNA2의 혼합 사용은 두 가지의 장점을 결합하여 더 나은 반응 효율을 달성 할 수 있습니다.
CRISPR/Cas13a-MSRV 검출 반응 조건 및 검출 결과를 최적화
a. crRNA를 이용한 표준 RNA의 검출 결과를 서로 다른 스페이저 염기서열과 비교한다.
b. 탐지 시스템에서 다른 온도에서 검출한 표준 RNA의 형광 신호 데이터를 비교하는 것.
c. 서로 다른 농도의 RNA 리포터 프로브를 이용하여 검출된 표준 RNA의 형광 신호 데이터의 비교
d. 서로 다른 농도 비율로 Cas13a/crRNA 탐사 복합체를 사용하여 검출된 표준 RNA의 검출 결과를 비교하는 것.
검출 시스템에 반응 온도의 영향을 탐구하기 위해 31°C, 34°C, 37°C 및 41°C의 다른 반응 온도를 설정했습니다.CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템의 최적 반응 온도는 37°C였습니다..
ssRNA 리포터 프로브 농도의 검출 시스템에 미치는 영향을 탐구 범위 내에서 탐지하기 위해,플루오레센스 강도는 ssRNA 리포터 탐사 수량 농도와 긍정적으로 상관관계가 있었습니다.ssRNA 리포터 프로브 농도의 검출 효과는 500-700nmol/L에서 크게 다르지 않았습니다.최적의 ssRNA 리포터 탐사체 농도는 500 nmol/L입니다..
다른 Cas13a 및 crRNA 반응 농도 비율이 검출 시스템에 미치는 영향을 탐구하기 위해, Cas13a:crRNA의 비율이 100 nmol/L 당 비율을 기반으로 4:1 및 3:1 였을 때,Cas13a 포화 수준에 도달Cas13a의 양이 일정했을 때, 형광 신호의 강도는 crRNA의 양 증가와 긍정적으로 상관관계가 없었습니다.Cas13a와 crRNA의 비율이 2일 때:1, CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템은 최대 탐지 활동을 달성 할 수 있습니다.
감수성 평가
CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템으로 MSRV의 최소 탐지 농도를 탐구하기 위해,RNA 표준은 10번 연속으로 희석되어 CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템으로 검출되었습니다.CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템은 MSRV 표적 RNA의 최소 100fM를 탐지할 수 있습니다.기계에 의해 검출된 형광 신호는 빈 컨트롤의 신호와 크게 다르지 않습니다.따라서 CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템은 MSRV ssRNA의 최소 100fM를 탐지할 수 있습니다.
CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템의 MSRV의 특수성 평가
표본 검사
해바라기 농장에서 수집한 질병의 명백한 징후가 있는 병든 물고기의 샘플에서 병든 물고기가 감염된 병원체가 MSRV인지 확인했습니다.우리는 PCR 증폭을 위해 MSRV 캡시드 단백질 염기서열에 특화된 프라이머를 사용했습니다.전기분해 다이어그램에 있는 해당 대역을 테스트를 위해 보냈습니다.
MSRV 염기서열 정보의 확인
a. MSRV 프라이머의 228 bp 제품 대역의 PCR 증폭; b. NCBI와 비교하여 MSRV 캡시드 단백질 염기서열, 대담한 염기서열은 프라이머 결합 부위 전류 및 하류,그리고 그림자 영역은 CRISPR/Cas13a-MSRV crRNA1 결합의 목표 위치입니다.
MSRV에 감염된 생선 표본은 바이러스 RNA에 대한 사전 치료와 사전 증폭을 거쳐샘플의 cDNA가 일반적인 qPCR와 비교하기 위해 추출되었습니다.CRISPR/Cas13a-MSRV 검출 시스템으로 검출된 양성 샘플 (No. 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 및 15) 은 일반적인 qPCR 결과와 동일했습니다.qPCR의 CQ 값이 18에서 25 사이였을 때음성 표본의 임계주기 수 (No. 1, 2, 4, 5, 9, 10 및 11) 는 38보다 많았으며, 표본이 MSVR 바이러스를 가지고 있지 않다는 것을 나타냅니다.CRISPR/Cas13a-MSRV 검출 시스템과 기존 RT-qPCR의 검출 데이터가 일치했습니다., CRISPR/Cas13a-MSRV 탐지 시스템이 실행 가능하고 원래의 전통적인 복잡한 탐지 방법을 어느 정도 대체 할 수 있음을 나타냅니다.
샘플 qPCR 검출 데이터와 qPCR 및 CRISPR의 수직 비교 차트
a. MSRV 임상 표본의 임상 표본 임계주기 번호 다이어그램의 qPCR 검출; 검출된 표본 주기 번호는 T 테스트 분석 (**P<0.01) 를 사용하여 부정적인 참조 주기 번호와 비교되었습니다.
b. MSRV 임상 샘플 형광 다이어그램의 MIRA 검출과 결합된 Cas13a검출된 샘플 형광값은 T 테스트 분석을 사용하여 부정적인 참조 형광값과 비교되었습니다 (**P<0.01)
요약하자면, 이 연구에서 개발된 CRISPR/Cas13a-MSRV 검출 방법은 비싼 실험 기구를 필요로 하지 않아 현장 검출이 빠르고 정확하고 편리합니다.이 검출 방법이 실제 번식 과정에서 MSRV를 적시에 발견하고 목표적이고 효과적인 조치를 취하기 위해 사용된다면이 검출 방법은 또한 신속하고 민감하고 특정하며,그리고 적용과 홍보에 큰 가능성을 가지고 있습니다..
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